Troubleshooting in der HPLC

Problem mögliche Ursache Lösungsvorschlag
Kein Druck oder zu niedriger Druck Pumpe hat sich abgeschaltet (Sicherheitsschaltung wg. zu hohem oder zu niedrigem Säulendruck ) Pumpe reaktivieren, System auf Verstopfung kontrollieren (siehe zu hoher Druck) Pumpe reaktivieren, System auf Lecks kontrollieren (siehe kein Druck)
  Leck in der Anlage Injektionsventil, Verbindungen, Säulenanschlüsse, Säulen auf Dichtigkeit prüfen.
Luftblasen in der Pumpe Pumpe entlüften (Herstelleranweisungen beachten). Möglichkeiten:Pumpe mit hohem Fluss bei ausgebauter Säule oder geöffnetem Bypass-Ventil fahren. Mit einer Spritze Fließmittel durch die Pumpe saugen
Pumpenventile defekt, öffnen bzw. schließen nicht., Pumpkolbendichtung defekt Ventile bzw. Dichtungen ausbauen; reinigen oder ersetzen.
Kein Fluss Probleme mit Fließmittelförderung, siehe kein Druck Siehe kein Druck
Schwankender Druck Unregelmäßige Fließmittelförderung Siehe kein Druck
  Lösungsmittelfilter verstopft Filter ausbauen und reinigen, danach Pumpe entlüften (Herstelleranweisungen beachten). Möglichkeiten: Pumpe mit hohem Fluss bei ausgebauter Säule oder geöffnetem Bypass-Ventil fahren. Mit einer Spritze Fließmittel durch die Pumpe saugen
Ventile der Pumpe defekt Ventile in Ultraschallbad reinigen oder austauschen
Kolben oder Kolbenfeder defekt Pumpenkopf ausbauen und Kolben bzw. Federn überprüfen
System oder Pumpe leck Leck suchen und abdichten.
Zu hoher Druck Vorsäule verstopft Vorsäule auswechseln
  Säule (Säulenkopf) verstopft Fritte auswechseln Säule umdrehen und spülen Neue Säule  
Verstopfung im System Vom Detektor aus zurückgehend nacheinander die Komponenten abkoppeln, dabei Druck beobachten. Verstopfung durch Reinigen oder Auswechseln der Komponente beseitigen. Injektionsventil prüfen, evtl. Rotorseal austauschen
Basislinienrauschen - regelmäßig Pulsierende Druckschwankungen durch die Pump Druckdämpfer einbauen
Basislinienrauschen - unregelmäßig
Leck im System Injektionsventil, Verbindungen, Säulenanschlüsse, Säulen auf Dichtigkeit prüfen.
  Temperaturunterschiede zwischen Detektorzelle und Eluent (bes. bei hoher Säulentemperatur). Säulentemperatur verringern oder Wärmeaustauscher einbauen.
ausgefallene Puffersalze, besonders bei hohem Anteil org. Fließmittel am Ende eines Gradienten in der Reversed Phase Chrom. Puffer mit niedrigerem Anteil Salz (max. 5mMol) verwenden, Acetonitril durch Methanol ersetzen.
Luftblasen in der Detektorzelle   entgastes Lösungsmittel verwenden, Blasen durch Spülen der Zelle beseitigen, evtl. unter Verwendung von Isopropanol (ohne Säule!)
unvollständige Mischung der mob. Phase Eluenten auf Mischbarkeit prüfen, evtl. Zusammensetzung ändern
Schwankungen in der Zusammensetzung der mobilen Phase durch Mehrkanalpumpe (bes. bei kurzwelliger UV-Detektion) Eluent vormischen, zusätzliche Mischkammer einbauen, nur einen Pumpenkanal benutzen.
Detektorlampe abgenutzt Lampe auswechseln
Detektorzelle verschmutzt Fenster reinigen, evtl. austauschen.
Durchlässigkeit der optischen Einheit durch Alterung der Einheit zu gering. Mit neuer Lampe absolute Intensität messen, bei zu geringer Intensität Service kontaktieren.
Zu hohe UV-Adsorption Eluent ist bei eingestellter UV-Wellenlänge unzureichend UV-durchlässig. Zur Überprüfung UV-Spektrum des Eluenten messen. Lösungsmittel höherer Qualität verwenden.
Driftendes Detektorsignal Nach einem Eluentenwechsel hat sich das Gleichgewicht auf der Säule noch nicht eingestellt. Säule spülen.
  Verunreinigungen hoher Retention eluieren bei isokratischen Arbeiten. Säulen mit starkem Eluent spülen und neu equilibirieren, evtl. Gradienten fahren, Eluent auf Verunreinigungen prüfen.
Verunreinigungen sammeln sich in der Detektorzelle. Detektorzelle mit geeignetem Lösungsmittel spülen .
Temperaturschwankungen in Säule oder Detektor (bes. bei RI-Detektion oder UV-Detektion mit hoher Empfindlichkeit. Mit Säulenofen arbeiten, Wärmeaustauscher zwischen Säule und Detektor einbauen, System vor direkter Sonneneinstrahlung und Zugluft schützen, Detektor thermostatisieren oder einfach den verdammten Kaffee vom Detektor nehmen.
Keine Peaks, schwankende Peakhöhen,  Kein Fluss durch den Detektor, Leck Verbindungen, Säulenanschlüsse, Säulen auf Dichtigkeit prüfen. Siehe kein Druck / niedriger Druck  
  Nicht reproduzierbares Probenaufgabesystem Probenaufgabesystem auf Lecks oder Verstopfungen prüfen, bei Bedarf reinigen. Bei Aufgabeventilen Rotor oder Kapillarverbindungen tauschen. Ansaugnadel von Autosamplern auf  Verstopfung prüfen und bei Bedarf tauschen  
Zu breite Peaks Vorsäule verschmutzt oder verbraucht. Vorsäule austauschen
  Säulenkopf verschmutzt Eingangsfritte oder Filter wechseln.
Säule verschmutzt oder verbraucht. Säule (rückwärts) spülen, evtl. Säule wechseln.
Säule überladen. Probe verdünnen, Injektionsvolumen verringern.
Falsche mobile Phase Zusammensetzung der mobilen Phase ändern.
Viskosität zu hoch z.B. Acetonitril statt Methanol benutzen.
Falsche pH-Einstellung bei Puffern Mit versch. pH-Werten Veränderung der Peakform testen.
Pufferkonzentration zu niedrig Konzentrierteren Puffer verwenden, evtl. anderes Salz zur Erhöhung der Ionenstärke zufügen (Natruimsulfat, Natriumperchlorat).
Leck zwischen Säule und Detektor Abdichten
Säulentemperatur zu niedrig. Temperatur im Säulenofen erhöhen.
Zu großes Außensäulenvolumen. Kürzere Verbindungskapillaren mit kleinem Innendurchmesser benutzen, Kapillarverbindungen auf Totvolumen prüfen.
Dämpfung des Integrators zu hoch eingestellt, Bunchrate zu hoch eingestellt. Peakbreite, Bunchrate niedriger einstellen und damit die "Empfindlichkeit" des Integrators erhöhen, niedrigere Zeitkonstante einstellen.
Peaks mit Schultern Vorsäule defekt oder verschmutzt Neue Vorsäule
  Säulenkopf verschmutzt Eingangsfritte oder Filter wechseln.
Totvolumen im Säulenkopf oder schlechte Säulenpackung Neue Säule
Falsches Proben-Lösungsmittel  Probe in der mobilen Phase lösen. Wenn nicht möglich, sehr wenig Probe aufgeben.
Peaktailing Störende Substanzen in Probe Säule mit Testmischung oder mit Reinsubstanz testen
  Adsorption der Probe auf Säule (besonders bei basischen Substanzen. Phase wechseln (z.B. Select B Phase für basische Substanzen), Puffer benutzen.
 . pH-Wert der mobilen Phase verändern (lipophile Basen in RPC bei pH 3-5) Mobile Phase mit basischer Substanz versetzen um Adsorption des Sorbens abzusättigen (z.B. 0,01% Triethylamin),  evtl. zusätzlich pH schwach sauer einstellen (Triethylamin + Trifluoressigsäure) UV-Detektion nur oberhalb 220nm (isokratisch) bzw. 240 nm (gradient) möglich. Umsteigen auf Ionenpaarchromatographie
Peakfronting Störende Substanzen in Probe Säule mit Testmischung oder Kalibirierprobe testen.
  Säule überladen Probe verdünnen, Injektionsvolumen verringern.
Falsches Proben-Lösungsmittel  Probe in der mobilen Phase lösen. Wenn nicht möglich, sehr wenig Probe aufgeben.
Schwankende Retentionszeiten Flussschwankungen  Leck vor Säule Schwankungen in der Zusammensetzung der mobilen Phase durch Pumpenstörung   siehe kein Druck, niedriger Druck siehe schwankender Druck
  fehlende oder nicht ausreichende pH-Kontrolle bei ionisierbaren Proben mit gepufferter mobiler Phase arbeiten Pufferkonz. erhöhen. evtl. Puffer wechseln.
Temperaturschwankungen der Säule Säule thermostatisieren.
Schwankungen des Wassergehaltes der mobilen Phase (bei Trennungen auf Kieselgel im Bereich sehr schwacher Elutionskraft) Wassergehalt der mobilen Phase reproduzierbar einstellen, org. Lösungsmittel wasserfrei halten (Trockenrohr)
Selektivitätsänderung der mobilen Phase Veränderung in der mobilen Phase (pH-Wert nicht korrekt eingestellt, Lösungsmittel verunreinigt) neue mobile Phase verwenden, Volumenanteile, Salzkonzentration und pH exakt einhalten
  Eluent nicht gepuffert Puffer einsetzen
Temperaturschwankungen der Säule Säule thermostatisieren.
Säule unumkehrbar verändert Neue Säule
Falsche Säule an der Anlage Immer wieder gerne gesehen: Der Kollege war am Gerät und hat die Säule ausgewechselt.
Wechsel des Säulenherstellers:  Die Selektivität der stationären Phasen ist bei verschiedenen Herstellern bzw. Refillern ähnlich, kann jedoch bei kritischen Trennungen größere Auswirkungen haben. Bei kritischen Trennungen nur Säulen vom gleichen Hersteller verwenden. Evtl. von der Charge Rücklage bilden
Reproduzierbarkeit der Säule: Auch bei einem Hersteller können Batch-to-batch Unterschiede auftreten möglichst lange mit der selben Charge arbeiten, mache Hersteller sind bereit, eine Charge nach Test für einen Anwender zu reservieren. Reproduzierbarkeit der stationären Phasen vom Hersteller dokumentieren lassen!